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三生国健公开抗EGFR/PD-1及抗HER2/PD-1双特异性抗体专利

抗EGFR/PD-1双特异性抗体》(WO2020103630)属于肿瘤治疗和生物技术领域,涉及一种抗EGFR和PD-1的双特异性抗体分子制备方法和用途。

EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor)是表皮生长因子(EGF)的受体,属于ErbB受体家族。EGFR是一种分子量为170KDa的跨膜糖蛋白,属于受体型酪氨酸激酶,在相关配体如EGF和转化生长因子-α(transforming growth factorα,TGFα)的作用下,EGFR由单体转化为二聚体而被激活,从而进一步活化下游信号传导通路,调控细胞的增殖。大量研究表明,在大多数肿瘤如胶质细胞癌、肾癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌等组织中存在EGFR的高表达或者异常表达。EGFR功能的异常与肿瘤细胞的增殖、血管生成、肿瘤侵袭、转移以及细胞凋亡的抑制有关。其功能的异常主要表现为两个方面:一是在肿瘤组织中的过度异常表达,二是EGFR突变体在肿瘤细胞中的持续性激活(不需要配体刺激或形成自循环刺激通路)。在结肠癌病人组织中,EGFR的表达率约为25-77%。相关临床数据表明,EGFR表达量的多少与肿瘤的恶性程度以及肿瘤患者的预后密切相关。

Erbitux(Cetuximab,IMC-C225)是针对EGFR的人鼠嵌合单克隆抗体,特异性地与EGFR结合,竞争性阻断EFGR与其配体结合,从而抑制EGFR信号传导。Erbitux于2004年2月被批准上市,用于与伊立替康联合治疗EGFR阳性、伊立替康化疗无效的转移性结直肠癌和联合放疗用于治疗局部区域性早期头颈部鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma of the head and neck,SCCHN)。由三生国健自主研发的EGFR单克隆抗体是按照Erbitux的氨基酸序列、用CHO细胞表达系统进行表达、并用自主研发的细胞培养生产工艺得到的人鼠嵌合单克隆抗体。体内外生物学活性以及抗肿瘤活性研究显示,三生国健药业自主研发的EGFR单克隆抗体与阳性对照药Erbitux具有极其相似的生物学活性,且其生物学活性在某些方面略优于阳性对照药Erbitux。

人程序性细胞死亡受体-1(PD-1)是由288个氨基酸组成的I型膜蛋白,胞外段为负责结合配体的Ig可变型(V-型)结构域,胞内段为负责结合信号转导分子的胞质尾区。PD-1胞质尾区含有两个基于酪氨酸的信号转导模体,分别为ITIM(免疫受体酪氨酸抑制作用模体)和ITSM(免疫受体酪氨酸转换作用模体)。PD-1表达在已经激活的T淋巴细胞表面,它与配体PD-L1(程序性死亡受体-配体1,programmed cell death-Ligand 1)和PD-L2(程序性死亡受体-配体2,programmed cell death-Ligand 2)结合可以抑制T淋巴细胞的活性及相关的体内细胞免疫反应。大量研究表明,PD-1和PD-L1的相互作用不仅维持了体内免疫系统的平衡,也是导致PD-L1表达阳性的肿瘤细胞规避免疫监视的主要机制。通过阻断PD-1/PD-L1信号通路,能够激活免疫系统,促进T细胞对肿瘤细胞的杀伤。

Keytruda是第一个上市的针对PD-1的人源化单克隆抗体,于2014年9月被FDA批准用于治疗黑色素瘤,至2018年获批的适应症包括:黑色素瘤、非小细胞肺癌、霍奇金淋巴瘤、头颈部鳞癌、膀胱癌、胃癌和带有MSI-H或dMMR的实体肿瘤。 (nivolμMab)是百时美施贵宝公司的一款PD-1单克隆抗体,于2014年12月获FDA批准上市,适应症包括:黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌、经典霍奇金淋巴瘤、头颈部鳞癌、膀胱癌、结直肠癌和肝细胞癌。中国专利申请CN201710054783.5公开了一种由三生国健药业自主研发的全新的抗PD-1人源化单克隆抗体。体内外生物学活性以及抗肿瘤活性研究显示,三生国健药业研发的PD-1单克隆抗体的生物学活性介于阳性对照药Opdivo和Keytruda之间,在某些方面略优于阳性对照药Opdivo。

双特异性抗体(bispecific antibody,BsAb)是指能同时结合两个(或多个)不同抗原表位的抗体分子。与传统的单克隆抗体相比,双特异性抗体具有独特的作用机制:1)双特异性抗体可以同时结合2个或多个不同的抗原分子或相同分子的不同表位,产生协同效应。而抗体联用往往不具备这种效应。2)介导细胞间的相互作用。双特异性抗体可分别结合到效应细胞和靶细胞上的两种抗原上,在效应细胞和靶细胞之间架起桥梁,促进细胞间的相互作用,例如介导免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤。因此双特异性抗体具有传统单克隆抗体不具备的独特优势。

  • 抗EGFR/PD-1双特异性抗体和阳性对照EGFR单抗对鳞癌A431细胞的IC 50分别为0.809nM和0.931nM,两者抑制活性相当。
  • 抗EGFR/PD-1双特异性抗体和阳性对照PD-1单抗阻断PD-1与PD-L1结合的IC 50分别为1.425nM和0.891nM,抗EGFR/PD-1双特异性抗体的抑制活性与PD-1单抗相当。
  • 抗EGFR/PD-1双特异性抗体对A431肿瘤细胞具有明显的抗体依赖的细胞杀伤效果,和阳性对照EGFR单抗相比,抗EGFR/PD-1双特异性抗体和EGFR单抗的EC 50分别为1.367nM和1.731nM,两者活性相当。
  • 抗EGFR/PD-1双特异性抗体对激活的CD4+T细胞没有明显的抗体依赖的细胞杀伤效果。
  • 抗EGFR/PD-1双特异性抗体在34mg/kg剂量时抑瘤率为53.7%,大致相同摩尔剂量下的EGFR单抗(25mg/kg)抑瘤率为63.6%,抗EGFR/PD-1双特异性抗体在低剂量为6.8mg/kg时抑瘤率为48.2%。在SW48移植瘤模型上,抗EGFR/PD-1双特异性抗体通过阻断EGFR抑制肿瘤生长。在相等摩尔剂量下,抗EGFR/PD-1双特异性抗体和阳性对照EGFR单抗的抑瘤效果相当,低剂量时(6.8mg/kg),抗EGFR/PD-1双特异性抗体也有抑瘤活性。
  • 第21天时,抗EGFR/PD-1双特异性抗体在16mg/kg剂量时抑瘤率为91.5%,大致相同摩尔剂量下的PD-1单抗(10mg/kg)抑瘤率为85.2%。在人源化PD-1小鼠MC38移植瘤模型上,抗EGFR/PD-1双特异性抗体可以通过阻断PD-1抑制肿瘤生长,且抑瘤效果与阳性对照PD-1单抗相当。
  • 和阴性空白对照组相比,100nM的抗EGFR/PD-1双特异性抗体能显著介导PBMC对SW-48肿瘤细胞的杀伤( ***P<0.001,P为偏差),并且杀伤效果呈现剂量依赖,高剂量组(终浓度为100nM)明显优于低剂量组(终浓度为10nM和1nM)。和单独用药组相比,抗EGFR/PD-1双特异性抗体明显优于EGFR单抗和PD-1单抗,和抗体联用组相比,100nM的抗EGFR/PD-1双特异性抗体也明显优于EGFR单抗加PD-1单抗的药物组合(两次实验分别为 #P<0.05和 ###P<0.001),表明抗EGFR/PD-1双特异性抗体在介导PBMC对SW-48肿瘤细胞的杀伤过程中具有协同效应。
本发明的抗EGFR/PD-1双特异性抗体在对靶细胞和抗原的亲和力、对鳞癌A431细胞的抑制活性、在SW48移植瘤模型上的抑瘤率都与阳性抗EGFR单抗或抗PD-1单抗相当;本发明抗EGFR/PD-1双特异性抗体对激活的CD4+T细胞没有明显的抗体依赖的细胞杀伤效果;在人源化PD1小鼠MC38移植瘤模型上,抗EGFR/PD-1双特异性抗体可以阻断PD1移植肿瘤生长,且抑瘤率略优于阳性对照。


抗HER2/PD1双特异性抗体》(WO2020103629)属于肿瘤治疗和生物技术领域,涉及一种抗HER2和PD1的双特异性抗体分子制备方法和用途。

信达生物抗PD-1/HER2双特异性抗体IBI315已进入临床I期;

HER2(human epidermal growth factor receptor2),具有受体酪氨酸蛋白激酶活性,是人表皮生长因子受体家族成员之一,只在成年人的少数正常组织中呈低水平表达。但研究表明,HER2在多种肿瘤中过表达,如在约30%的乳腺癌患者和16%的胃癌患者中均存在过度表达情况,HER2在肿瘤中的过表达可以显著促进肿瘤血管的新生、肿瘤的生长,并增强肿瘤的侵袭和转移能力,是这类患者预后较差的重要指征。因此,早在1998年,第一个靶向于HER2的单克隆抗体药物Herceptin(Genentech/Roche)被FDA批准上市,并用于HER2过表达的乳腺癌和胃癌的治疗。

  • 抗HER2/PD1双抗a,b和阳性对照HER2单抗与HER2结合的EC 50分别为0.1975,0.2294和0.221,三者亲和力相当。
  • 抗HER2/PD1双抗a,b和阳性对照PD1单抗与PD1结合的EC 50分别为0.1384,0.1525和0.1557。三者亲和力相当。
  • 抗HER2/PD1双抗a,b和阳性对照HER2单抗与细胞表面HER2高表达的人乳腺癌细胞BT474细胞结合的EC 50分别为1.64,5.669,1.556。其中抗HER2/PD1双抗a和阳性对照HER2单抗亲和力相当,而抗HER2/PD1双抗b与阳性对照HER2单抗相比,亲和力稍弱。
  • 以细胞表面表达PD1的CHO稳转细胞作为靶细胞,抗HER2/PD1双抗a,抗HER2/PD1双抗b都可以特异性的结合细胞表面表达的PD1。抗HER2/PD1双抗a和阳性对照PD1单抗EC 50分别为1.777和0.8981;抗HER2/PD1双抗b和阳性对照抗PD1单抗EC 50分别为1.192和0.8891。三者亲和力相当。
  • BT474细胞体外增殖抑制作用,抗HER2/PD1双抗a,抗HER2/PD1双抗b和阳性对照HER2单抗IC 50分别为0.4967、0.9427、0.5914。三者抑制率相当。
  • 结果表明,抗HER2/PD1双抗a、b与抗原PD1和HER2有良好的亲和力。
  • 由于HER2/PD1双抗不仅可以结合肿瘤细胞,结合表达PD-1的T细胞,抗体的Fc段还可以结合NK细胞。活化的T细胞上表达PD1,加入抗HER2/PD1 双抗a抗体与其结合,而抗HER2/PD1双抗a的Fc段与效应细胞NK的Fc受体结合,NK细胞对CD4+T细胞无明显杀伤作用,仅在抗HER2/PD1双抗a高浓度下有微弱的杀伤;
  • BT474细胞表面表达HER2抗原,加入抗HER2/PD1双抗a可与其结合。而抗HER2/PD1双抗a的Fc段与效应细胞NK的Fc受体结合,NK细胞对BT474肿瘤细胞有明显杀伤作用,结果与HER2单抗相似。
  • 采用慢病毒转染法,将PD-L1基因重组到人胃癌细胞株NCI-N87。构建的N87-PDL1细胞,FACS检测细胞表面高表达PD-L1。抗HER2/PD1双抗a杀伤肿瘤的效果优于HER2单抗,并且优于抗HER2单抗加PD1单抗,说明双抗发挥了协同抗肿瘤的作用。
  • 在人胃癌细胞株NCI-N87移植瘤模型上,抗HER2/PD1双抗a与阳性对照HER2单抗近似。
  • 在人源化PD1小鼠MC38移植瘤模型上,抗HER2/PD1双抗a可以通过阻断PD1抑制肿瘤生长,抑瘤效果与阳性对照PD1单抗近似。
由上述实验可知,本发明提供的双特异性抗体,结构稳定。能同时结合HER2和PD1抗原。阻断HER2信号通路,可抑制表达HER2抗原的肿瘤细胞增殖;同时能阻断PD-1/PD-L1通路,可恢复T细胞的免疫杀伤功能,发挥杀伤肿瘤细胞的作用。同时,此双抗HER2抗体的Fc段可以与NK细胞的Fc受体结合,发挥ADCC效应,杀伤肿瘤细胞,而对T淋巴细胞并无明显杀伤作用。

评论

匿名说…
害,还要多久才能上市,不过还是充满了幻想?